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本产品是一种用于从大肠杆菌中进行小量质粒快速抽提的离心柱式试剂盒。本试剂盒抽提所得到的质粒可直接用于转染细胞，DNA测序，PCR，基于PCR的突变，体外转录，转化细菌，内切酶消化等。

本试剂盒适用于常用的EndA^-菌株DH5α、JM109和XL-1 blue等。对于EndA⁺菌株如JM110、BL21(DE3)、TG1和HB101等，可以顺利完成质粒抽提，但从EndA⁺菌株中抽提获得的质粒会有轻微的核酸酶污染，如果在内切酶缓冲液中37℃孵育1小时会导致质粒全部降解。从EndA⁺菌株中抽提质粒时推荐使用我公司的通用型质粒小量抽提试剂盒(YTB4001)、通用型质粒中量抽提试剂盒(YTB4002)和通用型质粒大量抽提试剂盒(YTB4003)。

野生型大肠杆菌中表达Endonuclease I，能切割并降解双链DNA。编码Endonuclease I的基因是endA，如果endA突变失活，其基因型会被标注为endA1，相应的突变菌株被称为EndA^-菌株，而野生型菌株则被称为EndA⁺菌株。常见的EndA^-和EndA⁺菌株参见附表1。从EndA⁺菌株中抽提的质粒，微量核酸酶和质粒结合而容易被共纯化，导致容易降解。

本试剂盒采用了一种新型的离子交换柱。在特定条件下，使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱上，在一定条件下又能将质粒充分洗脱，从而实现质粒的快速纯化。无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀，12个样品只需不足30分钟即可完成。

• 第一次使用前把试剂盒提供的RNase A全部加到溶液I (悬浮液)中，混匀，并在瓶上做好标记。加入RNase A后4℃存放。
• 第一次使用前在18mL溶液IV中加入27mL无水乙醇(36mL溶液IV中加入54mL无水乙醇)，混匀，并在瓶上做好标记。
• 温度较低时，溶液II和溶液III可能会有沉淀产生。使用前必须检查一遍。如有沉淀，37℃水浴加热溶解，混匀后使用。溶液II请勿过分剧烈混匀，否则会产生大量气泡。
• 溶液II使用完后，一定要盖紧瓶盖，防止被空气中二氧化碳酸化。
• 溶液II有强碱性，溶液II、溶液III和溶液IV对人体有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护以避免直接接触人体或吸入体内。
• 本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
• 废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。

• 取过夜菌1.5mL，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清。再重复一次，每管共收集3mL过夜菌沉淀。
  通常大肠杆菌宜用LB培养过夜(16小时左右)至OD值为2～4。建议5000g(通常为5000rpm左右)室温离心1分钟，如沉淀不充分则适当延长离心时间。时间过长或离心速度过快会使沉淀过于紧密，不利于加入溶液I后散开沉淀。直接倒掉上清，再倒入约1.5mL菌液并重复上述操作，然后倒置于吸水纸上(可用普通草纸)，使液体流尽。如果细菌密度明显偏低，可考虑使用更多菌液，再重复上述操作1～2次。对于高拷贝质粒所用菌量一般不能超过5mL，对于低拷贝质粒所用菌量一般不能超过10mL。过量的细菌会导致后续的裂解不充分。
• 每管加入250μL溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块。
  确认溶液I中已经添加了RNase A。最高速度vortex 5～10秒或更长时间，悬起沉淀。一定要充分混匀，对着光亮处观察应呈均匀的悬浊液，无明显细菌团块或絮块。如果没有vortex，可以用枪吹打沉淀使沉淀逐渐散开或用手指把沉淀弹开。
• 每管加入250μL溶液II，轻轻颠倒离心管4～6次，使细菌完全裂解，溶液透明。
  切勿vortex！vortex或其它剧烈操作会导致基因组DNA断裂，易导致最终所得质粒被基因组DNA污染。颠倒4～6次后，溶液应变得透明，无团块或絮状物。如果加入溶液I后细菌没有完全散开，那么颠倒4～6次后，可能还会有团块或絮状物。遇到有少量团块或絮状物产生的情况，可以增加颠倒次数3～5次，再室温放置2～3分钟，但总裂解时间不可超过5分钟。
• 每管加入350μL溶液III，随即颠倒离心管4～6次混匀，可见白色絮状物产生。
  切勿vortex！颠倒次数也不宜过多，否则易导致最终所得质粒的质量下降。
• 最高速(13000rpm左右)室温离心10分钟。
  离心后会产生白色沉淀。离心时准备好下一步需使用的质粒纯化柱，废液收集管，并在纯化柱上做好标记。
• 将上一步骤离心后的上清倒入或吸入到质粒纯化柱内。最高速离心30～60秒，倒弃收集管内液体。
  质粒倒入质粒纯化柱后，可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。
• 在质粒纯化柱内加入750μL溶液IV，最高速离心30～60秒，洗去杂质，倒弃收集管内液体。
  加入溶液IV后可以不用等待，直接离心。倒弃收集管内的液体后，保留收集管继续使用。
• 再最高速离心1分钟，除去残留液体并使痕量乙醇完全挥发。
  注意：倒弃收集管内液体后再离心，才能彻底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV会影响质粒的质量。
• 将质粒纯化柱置于洁净1.5mL离心管上，加入50μL溶液V至管内柱面上，放置1分钟。
  溶液V需要直接加至管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果不慎将溶液V沾在管壁上，一定要震动离心管，使液体滑落到管底，以便被纯化柱吸收。也可以用重蒸水或Milli-Q级纯水替代溶液V，但是水的pH应不小于6.5。溶液V加入后放置时间稍长，对于增加质粒产量会略有帮助。如想得到较高浓度的质粒，可以加入35μL溶液V洗脱。
• 最高速离心1分钟，所得液体即为高纯度质粒。
  通常所得质粒浓度为0.1～0.3mg/mL左右。如果想得到高浓度的质粒，可以采用常规的乙醇沉淀方法浓缩质粒。